PCR擴(kuò)增儀又稱為PCR基因擴(kuò)增儀、PCR核酸擴(kuò)增儀、聚合酶鏈反應(yīng)核酸擴(kuò)增儀，是利用PCR(Polymerase chain reaction，聚合酶鏈反應(yīng))技術(shù)對(duì)特定DNA擴(kuò)增的一種儀器設(shè)備，被廣泛運(yùn)用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中，例如用于判斷檢體中是否會(huì)表現(xiàn)某遺傳疾病的圖譜、傳染病的診斷、基因復(fù)制以及親子鑒定等。

發(fā)展歷史

1971年，Dr. Kjell Kleppe首次在Journal of molecular biology期刊發(fā)表的文章中準(zhǔn)確、客觀地闡述了PCR方法。

1985年，美國PE-Cetus公司的Kary Mullis等人發(fā)明PCR技術(shù)。它推動(dòng)了現(xiàn)代醫(yī)學(xué)由細(xì)胞水平向分子水平、基因水平發(fā)展，是DNA測(cè)序的基礎(chǔ)，它成為現(xiàn)代分子生物學(xué)發(fā)展過程中的一座里程碑。Mullis等也因此獲得了1993年的諾貝爾獎(jiǎng)。

基本構(gòu)造

PCR擴(kuò)增儀通常由熱蓋部件、熱循環(huán)部件、傳動(dòng)部件、控制部件和電源部件等部分組成 [1]  。

PCR擴(kuò)增儀結(jié)構(gòu)示意圖

工作原理

PCR技術(shù)的原理類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物，由變性-退火-延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成 [2]  。

1. 模板DNA的變性

模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備。

2. 模板DNA與引物的退火(復(fù)性)

模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合。

3. 引物的延伸

DNA模板-引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。

重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一輪循環(huán)需2~4分鐘，如此反復(fù)進(jìn)行，每一輪循環(huán)所產(chǎn)生的DNA均能成為下一輪循環(huán)的模板，每一輪循環(huán)都使兩條人工合成的引物間的DNA特異區(qū)拷貝數(shù)擴(kuò)增1倍，PCR產(chǎn)物以2的指數(shù)形式迅速擴(kuò)增，經(jīng)過25~30輪循環(huán)后(2~3小時(shí))，理論上可使基因擴(kuò)增109倍以上，實(shí)際上一般可達(dá)106~107倍。

  PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

PCR的三個(gè)反應(yīng)步驟反復(fù)進(jìn)行，使DNA擴(kuò)增量呈指數(shù)上升。反應(yīng)最終的DNA擴(kuò)增量可用y=(1+X)n計(jì)算。Y代表DNA片段擴(kuò)增后的拷貝數(shù)，X表示平均每次的擴(kuò)增效率，n代表循環(huán)次數(shù)。平均擴(kuò)增效率的理論值為100%，實(shí)際反應(yīng)初期，靶序列DNA片段的增加呈指數(shù)形式，隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累，被擴(kuò)增的DNA片段不再呈指數(shù)增加，而進(jìn)入線性增長期或靜止期，即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)”，使平均效率達(dá)不到理論值 [2]  。

標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系

參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)為模板、引物、耐熱DNA聚合酶、三磷酸脫氧核苷酸和鎂離子，其中關(guān)鍵步驟是最佳引物的設(shè)計(jì) [2]  。

1. 模板核酸

模板(靶基因或樣品DNA)核酸的量與純化程度是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。一般臨床檢測(cè)標(biāo)本，可采用快速簡(jiǎn)便的方法溶解細(xì)胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴(kuò)增。DNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止核糖核酸酶(ribonuclease，RNase)降解RNA。

2. 引物

PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈作引物。每條引物鏈的濃度為0.1~1μmol或10-100pmol，以反應(yīng)所需要的最低引物量的濃度為好。

3. DNA聚合酶

TaqDNA聚合酶基因全長2496個(gè)堿基，75~80℃時(shí)每個(gè)酶分子每秒鐘可延伸約150個(gè)核苷酸，在PCR循環(huán)的高溫條件下仍能保持較高的活性和良好的熱穩(wěn)定性，溫度過高(90℃以上)或過低(22℃)都可影響TaqDNA聚合酶的活性。目前，有兩種TaqDNA聚合酶供應(yīng)，一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。

4. 三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)

dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系。在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50-200μmol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等(等摩爾配制)，濃度過低又會(huì)降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。

5. 鎂離子濃度

Mg2+能與dNTP結(jié)合，Mg2+對(duì)PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響。在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為20μmol/L時(shí)，Mg2+濃度為1.5~2.0mmol/L為宜，Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增：濃度過低，會(huì)降低taqDNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。

PCR的反應(yīng)條件

PCR反應(yīng)條件為溫度、時(shí)間和循環(huán)次數(shù)。

1. 溫度與時(shí)間的設(shè)置：基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸3個(gè)溫度點(diǎn)。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中，雙鏈DNA在90~95℃變性，再迅速冷卻至40~60℃，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至70~75℃，在 TaqDNA聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。

2. PCR反應(yīng)時(shí)間：變性時(shí)間一般2~3min，可以使模板DNA完全變性。復(fù)性時(shí)間一般為30~60s，足以使引物與模板之間完全結(jié)合。PCR延伸反應(yīng)的時(shí)間可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長度而定，一般1kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時(shí)間1min是足夠的。

3. 循環(huán)次數(shù)：循環(huán)次數(shù)決定PCR擴(kuò)增程度。PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。一般的循環(huán)次數(shù)選在30-40次之間，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多

  產(chǎn)品分類

根據(jù)DNA擴(kuò)增的目的和檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)，可以將PCR儀分為普通PCR儀，梯度PCR儀，原位PCR儀，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀四類。

1. 普通PCR儀

一次PCR擴(kuò)增只能運(yùn)行一個(gè)特定退火溫度的PCR儀稱作傳統(tǒng)PCR儀，也叫普通PCR儀。如果要做不同的退火溫度需要多次運(yùn)行。主要是用于簡(jiǎn)單的、對(duì)目的基因退火溫度的擴(kuò)增。該儀器主要應(yīng)用于科學(xué)研究、教學(xué)、醫(yī)學(xué)臨床、檢驗(yàn)檢疫等機(jī)構(gòu)。

2. 梯度PCR儀

一次性PCR擴(kuò)增可以設(shè)置一系列不同的退火溫度條件（溫度梯度，通常有12種溫度梯度）的PCR儀稱作梯度PCR儀。因?yàn)楸粩U(kuò)增的不同DNA片段，其最適退火溫度是不同的，通過設(shè)置一系列的梯度退火溫度進(jìn)行擴(kuò)增，從而一次性PCR擴(kuò)增，就可以篩選出表達(dá)量高的最適退火溫度，進(jìn)行有效的擴(kuò)增。用于研究未知DNA退火溫度的擴(kuò)增，這樣節(jié)約成本的同時(shí)也節(jié)約了時(shí)間。梯度PCR儀在不設(shè)置梯度的情況下也可以做普通PCR擴(kuò)增。主要應(yīng)用于科研、教學(xué)機(jī)構(gòu)。

3. 原位PCR儀

用于從細(xì)胞內(nèi)靶DNA的定位分析的細(xì)胞內(nèi)基因擴(kuò)增儀稱作原位PCR儀。如病源基因在細(xì)胞的位置或目的基因在細(xì)胞內(nèi)的作用位置等。是保持細(xì)胞或組織的完整性，使PCR反應(yīng)體系滲透到組織和細(xì)胞中，在細(xì)胞的靶DNA所在位置上進(jìn)行基因擴(kuò)增。不但可以檢測(cè)到靶DNA，又能標(biāo)出靶序列在細(xì)胞內(nèi)的位置，對(duì)于在分子和細(xì)胞水平上研究疾病的發(fā)病機(jī)理和臨床過程及病理的轉(zhuǎn)變有重大的實(shí)用價(jià)值。主要應(yīng)用于臨床、科研。

4. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀

在普通PCR儀的基礎(chǔ)上增加一個(gè)熒光信號(hào)采集系統(tǒng)和計(jì)算機(jī)分析處理系統(tǒng)的PCR儀稱作熒光定量PCR儀。其PCR擴(kuò)增原理和普通PCR儀擴(kuò)增原理相同，只是PCR擴(kuò)增時(shí)加入的引物是利用同位素、熒光素等進(jìn)行標(biāo)記，使用引物和熒光探針同時(shí)與模板特異性結(jié)合擴(kuò)增。擴(kuò)增的結(jié)果通過熒光信號(hào)采集系統(tǒng)實(shí)時(shí)采集信號(hào)連接輸送到計(jì)算機(jī)分析處理系統(tǒng)得出量化的實(shí)時(shí)結(jié)果輸出。把這種PCR儀叫做實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（qPCR儀）。熒光定量PCR儀有單通道、雙通道和多通道。當(dāng)只用一種熒光探針標(biāo)記的時(shí)候，選用單通道，有多熒光標(biāo)記的時(shí)候用多通道。單通道也可以檢測(cè)多熒光的標(biāo)記的目的基因表達(dá)產(chǎn)物，因?yàn)橐淮沃荒軝z測(cè)一種目的基因的擴(kuò)增量，需多次擴(kuò)增才能檢測(cè)完不同目的基因片段的量。主要用于醫(yī)學(xué)臨床檢測(cè)、生物醫(yī)藥研發(fā)、食品行業(yè)、科研院校等機(jī)構(gòu)。

根據(jù)DNA擴(kuò)增時(shí)升溫介質(zhì)的不同可以將PCR儀分為：變溫鋁塊式PCR儀、水浴式PCR儀和變溫式流式PCR儀。

1. 變溫鋁塊式PCR儀

熱源用電阻絲、導(dǎo)電熱膜、熱泵式珀?duì)柼雽?dǎo)體元件制作，讓帶有凹孔的鋁塊升溫，用自來水、制冷壓縮機(jī)或半導(dǎo)體降溫。優(yōu)點(diǎn)：溫度傳導(dǎo)快，各管的擴(kuò)增一致性好；反應(yīng)管規(guī)格一致時(shí)無須外涂石蠟油；可用微電腦調(diào)節(jié)溫度轉(zhuǎn)換；儀器制冷部件可以在完成擴(kuò)增后降溫至4℃，保存樣品過夜。缺點(diǎn)：管內(nèi)反應(yīng)液溫度比鋁塊顯示溫度滯后；須使用特制且與鋁塊凹孔形狀緊密吻合的薄壁耐熱反應(yīng)管；變溫時(shí)難以快速克服鋁塊的熱容量；壓縮機(jī)制冷啟動(dòng)慢、重量大、滯后時(shí)間長。

2. 水浴式PCR儀

儀器本身有3個(gè)不同溫度的水浴，用機(jī)械裝置將帶有反應(yīng)管的架子移位和升降溫度，使溫度循環(huán)。優(yōu)點(diǎn)：水為傳熱介質(zhì)，溫度易恒定，熱容量大；反應(yīng)管形狀無特殊要求，溫度轉(zhuǎn)換較快擴(kuò)增效果穩(wěn)定；具有較高的運(yùn)行效率，擴(kuò)增產(chǎn)物特異性好。缺點(diǎn)：高溫浴不穩(wěn)定，水面需用液體石蠟覆蓋；改變水浴溫度所需時(shí)間較長，不易實(shí)施復(fù)雜程序（如套式PCR）的操作，儀器體積較大；室溫影響溫度下限。

3. 變溫式流式PCR儀

依據(jù)空氣流的動(dòng)力學(xué)原理，以冷熱氣流為介質(zhì)升降溫度。優(yōu)點(diǎn)：變溫迅速，擴(kuò)增效果好，適合于微量、快速PCR；反應(yīng)器不受形狀限制，管外無需涂液體石蠟；測(cè)定管內(nèi)液體溫度作為控溫依據(jù)，顯示溫度真實(shí)可靠；易于用微電腦設(shè)定復(fù)雜的變溫程序；易于制成重量較輕的便攜式儀器，適合外出作業(yè)。缺點(diǎn)：以室溫為溫度下限，低溫難控制，對(duì)空氣流的動(dòng)力學(xué)要求較高，需精心設(shè)計(jì)才能使各管溫度均勻。

臨床應(yīng)用

感染性疾病的診斷：PCR技術(shù)在感染性疾病中尤其適用于檢測(cè)一些培養(yǎng)周期長或缺乏穩(wěn)定可靠檢測(cè)手段的病原體。

 

遺傳性疾病的診斷：遺傳性疾病的發(fā)病基礎(chǔ)是核酸分子結(jié)構(gòu)變異與核酸的表達(dá)產(chǎn)物，如蛋白質(zhì)或酶類分子結(jié)構(gòu)的改變。PCR技術(shù)的原理恰好為檢測(cè)這一類疾病提供了有效的手段。

 

惡性腫瘤的診斷：PCR技術(shù)用于癌基因和抑癌基因缺失與點(diǎn)突變的檢測(cè)以及腫瘤相關(guān)病毒基因的檢測(cè)，為臨床診斷帶來了簡(jiǎn)便快速、準(zhǔn)確的方法，同時(shí)也為腫瘤相關(guān)疾病的治療與預(yù)后提供了監(jiān)控手段。

 

移植配型：隨著PCR技術(shù)的出現(xiàn)，分子生物學(xué)技術(shù)被引入到HLA配型領(lǐng)域，通過PCR擴(kuò)增儀可以建立快速、準(zhǔn)確的HLA基因分型方法，滿足臨床移植配型的需要。

 

工作環(huán)境

環(huán)境溫度：5℃～40℃；相對(duì)濕度：不大于80%；環(huán)境清潔少塵，避免陽光直射；遠(yuǎn)離熱源、水源、強(qiáng)烈的電磁干擾源。

選擇較為堅(jiān)實(shí)的、不怕濕的臺(tái)面安置儀器，臺(tái)面高度適中，輕松操作。儀器四周留取一定空間，間隔20cm以上，用于通風(fēng)和散熱。供電線路需承受10A電流。提供良好接地將進(jìn)一步提高電氣安全性和系統(tǒng)可靠性。